Yra beveik visos įmonės, kurios pardavėbromelaino fermento milteliaiyra sumaišytas su papainu.Bromelainą sunku išvalyti iki 5000GDU/g. bet labai lengva papainą išvalyti iki 1000,000 GDU/g. net iki 2000 000 GDU/g. bet bromelaino funkcijos skiriasi nuo papaino. spalva, kvapas, tirpumas vandenyje ir skonis skiriasi nuo netikro produkto ir tikro produkto. Jie skiriasi tuo, kad tinkami bromelaino fermento milteliai yra pilki, bekvapiai, beskoniai ir netirpūs vandenyje.
Tačiau netikras bromelainas turi šias savybes:
● Jis yra šviesiai geltonas, aromatingas ir švelniai saldus, tirpus vandenyje. Tai būdinga papainui.
● Vartojamas uždegimui mažinti ir skausmui malšinti. bet papaine šių funkcijų beveik nėra.
● Jis naudojamas tik kaip maisto papildas, o ne kaip maisto priedas, bet iš tiesų gali būti farmacijos klasės. Tačiau papainas naudojamas tik kaip mėsos minkštinimo milteliai ir kosmetika.
Išbandėme bromelainą pagal SDS-PAGE gelį ir ŽELATINOS VIRŠKINIMO ĮRENGINIO ANALIZĖS ir HPLC metodus, SDS-PAGE gelio metodu tikslinių molekulių yra mažiau netikram produktui.
Toliau pateikiami SDS puslapio elektroforezės rezultatai
Aukščiau pateiktos dėmės rodo, kad tik tinkamas produktas turi tokias pačias dėmes tinkamoje paveikslėlio vietoje, tačiau netikras produktas turi mažai dėmių, o tai reiškia, kad molekulinė masė yra vos matoma.
Bromelaino molekulinė masė yra apie 33000, bet papaino molekulinė masė yra 21000. Ir HPLC chromatograma:
Pamatysite, kad tik tinkamame ekstrakte yra tinkamos bromelaino molekulinės masės ir jį galima aptikti HPLC.
Bet jei išbandėme tik želatinos virškinimo vieneto analizės metodu (GDU), žr. II priedą. Tiek teisingas, tiek klaidingas produktas turi tokius pačius rezultatus, kaip nurodyta toliau:
Ananaso stiebas yra labai pigus, o greitis nuo stiebo iki bromelaino yra labai mažas, gamybos procese yra tam tikra tarša.
Beveik visa bromelaino fermento miltelių gamykla yra netoli lauko. Jie naudoja šviežią stiebą. Neįmanoma išsiųsti stiebo dideliu atstumu. Žaliava turi būti tvarkoma kuo greičiau, kai ji surenkama iš lauko arba turi būti laikoma žemoje temperatūroje (4-8 laipsnis), kad būtų išvengta baltymų skilimo. Realiame gyvenime gamintojas iš tikrųjų negali įvykdyti nė vienos iš dviejų pirmiau minėtų sąlygų dėl per daug ananasų stiebų. Tinkamas metodas yra pusiausvyra tarp apdorojimo laiko ir baltymų aktyvumo praradimo. Paprastai neapdorotos žaliavos gaminamos ananasų derliaus nuėmimo sezono metu, o neapdorotos žaliavos laikomos žemos temperatūros aplinkoje (4-8 laipsnis).
Atliekame tam tikrą SDS puslapio elektroforezės testą. Teoriškai galime jį padidinti iki 10, 000 arba 20,000. bet tai bus labai brangu. 5000GDU/g ir padaryti jį stabilų, galbūt ant malto atramos / mikrokapsuliuoto ar kažko, plius organinės klasės ekstrahavimas / gryninimas.
I priedas
● 5 metodas SDS poliakrilamido gelio elektroforezė (SDS-PAGE)
SDS-PAGE yra denatūruoto poliakrilamido gelio elektroforezės metodas. Šio metodo baltymų atskyrimo principas pagrįstas tuo, kad dauguma baltymų gali susijungti su anijonine paviršinio aktyvumo medžiaga natrio dodecilsulfatu (SDS) tokiu svorio santykiu, kad susidarytų kompleksas.
Baltymų molekulių nešamas neigiamas krūvis gerokai viršija grynąjį natūralių baltymų molekulių krūvį, pašalindamas skirtingų baltymų molekulių krūvio poveikį ir atskirdamas baltymus pagal jų molekulinį dydį.
Šis metodas naudojamas kokybiniam baltymų identifikavimui, grynumo ir priemaišų kontrolei bei kiekybiniam baltymų nustatymui.
1 Prietaisas
Pastovios įtampos arba nuolatinės srovės maitinimo šaltinis, vertikali plokštelinė elektroforezės bakas ir klijų gamybos forma.
2. Reagentai
(1) Vanduo.
(2) Atskyrimo gelio buferis (4x, A tirpalas) 1,5 mol/L trihidroksimetilaminometano druskos rūgšties buferis. Pasverkite 18,15 g trihidroksimetilaminometano ir ištirpinkite jį atitinkamu kiekiu vandens. Sureguliuokite pH iki 88 su druskos rūgštimi ir praskieskite vandeniu iki 100 ml.
(3) Pasverkite 58.0g akrilamido ir 20 g N,N'-metilen-bisakrilamido 30 procentų akrilamido tirpale (B tirpale), ištirpinkite šiltame vandenyje ir praskieskite iki 200 ml, filtruokite filtravimo popieriumi (saugomi tamsus).
(4) Pasverkite 10 g natrio dodecilsulfato 10 procentų SDS tirpale (C tirpale), ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 100 ml
(5) Tetrametiletilendiamino tirpalo (TEMED, D tirpalas) komercializavimo reagentas.
10 procentų amonio persulfato tirpalas (E tirpalas) Pasverkite 10 g amonio persulfato, ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 100 ml. Rekomenduojama jį paruošti prieš naudojant arba laikyti atskirai -20 laipsnių temperatūroje 2 savaites.
(7) Koncentruotas kaučiuko buferis (4 ×, F tirpalas) 0,5 mol/l Trihidroksimetilaminometanas Vandenilio chlorido rūgšties buferis, pasverkite 6,05 g trihidroksimetilaminometano, įpilkite atitinkamą kiekį vandens, kad ištirptų, sureguliuokite pH iki 6,8 su druskos rūgštimi. rūgšties ir praskieskite vandeniu iki 100 ml.
(8) Elektrodo buferis (10 ×) Pasverkite 30 g trimetilaminometano, 144 g glicino ir 10 g natrio dodecilsulfato, ištirpinkite juos vandenyje ir praskieskite iki maždaug 800 ml. Sureguliuokite pH vertę iki 8.{7}}.8 su druskos rūgštimi ir praskieskite vandeniu iki 1000 ml.
(9) Nesumažintas mėginio buferis (4 ×) Pasverkite 303 g trimetilaminometano, 20 mg bromfenolio mėlynojo ir 8,0 g natrio dodecilo sulfato, išmatuokite 40 ml glicerolio, ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki maždaug 80 ml. Sureguliuokite pH iki 68 su druskos rūgštimi ir praskieskite vandeniu iki 100 ml.
(8) Elektrodo buferis (10 ×) Pasverkite 30 g trimetilaminometano, 144 g glicino ir 10 g natrio dodecilsulfato, ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki maždaug 800 ml. Sureguliuokite DH vertę iki 81-88 su druskos rūgštimi ir praskieskite vandeniu iki 1000 ml
(9) Nesumažintas mėginio buferis (4 ×) Pasverkite 3,03 g trimetilaminometano, 20 mg bromfenolio mėlynojo ir 80 g natrio dodecilsulfato, išmatuokite 40 ml glicerolio, ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki maždaug 80 ml. Sureguliuokite pH iki 6,8 su druskos rūgštimi ir praskieskite vandeniu iki 100 ml.
(10) Sumažintas bandomosios medžiagos buferis (4 ×) Pasverkite 3,03 g trimetilaminometano, 20 mg bromfenolio mėlynojo ir 80 g natrio dodecilsulfato, išmatuokite 40 ml glicerolio, ištirpinkite ir praskieskite vandeniu iki maždaug 80 ml ir įpilkite - 20ml merkaptoetanolio, sureguliuokite pH iki 6,8 su druskos rūgštimi, praskieskite vandeniu iki 100 ml (arba 3,03 g trimetilaminometano, 20 mg bromfenolio mėlynojo, 8,0 g natrio dodecilsulfato, išmatuokite 40 ml glicerolio, ištirpinkite vandenyje ir praskieskite iki 80 ml, sureguliuokite pH iki 6,8 su druskos rūgštimi, praskieskite vandeniu iki 100 ml ir prieš naudojimą įpilkite ditiotreitolio iki 100 mmol/l).
● II priedas
Želatinos virškinimo vieneto analizės metodas (GDU)
A. Tikslas. Ši procedūra naudojama bromelaino fermento miltelių proteolitiniam aktyvumui nustatyti.
B. Įranga:
1. pH matuoklis
2. Pastovios temperatūros vandens vonia 45.0 laipsnio ± 0,1 laipsnio
3. Analitinis balansas
4. Mūrinės kolbos
5. Tūrinės pipetės
6. Laikmatis
7. Skaitmeninė biuretė (0,1 ml tikslumas)
8. Dūmų gaubtas
9. Automatinės pipetės
C. Saugos priemonės:
Šis bandymas turi būti atliktas dūmų gaubte.
1. Naudokite standartines laboratorijos saugos praktikas.
2. Formaldehidas: Paruoškite ir visada laikykite traukos gaubte. Žinomas kancerogenas ir teratogenas.
3. Peroksidas: stiprus oksidatorius
D. Reagentai ir reagentų preparatai:
1. Distiliuotas vanduo: maždaug 500 ml: sureguliuokite pH iki 4,5 naudodami 0,1 N HCl.
2. Želatinos substratas:
a. 25 gramus želatinos (Mikrobiologie. 1.04070) ištirpinkite 375 ml karšto vandens, užvirinkite. Atvėsinkite iki 45 laipsnių.
b. Sureguliuokite pH iki 4,5 0,1 N HCl ir praskieskite iki 500 ml pH 4,5 distiliuoto vandens.
c. Želatinos substratą laikykite 45 laipsnių temperatūroje.
3. Buferinis tirpalas:
a. Lėtai įpilkite 15 g NaCl į 40-50 ml vandens 150 ml stiklinėje ir maišykite, kad ištirptų.
b. Įpilkite 0,570 ml acto rūgšties.
c. Sureguliuokite pH iki 4,5 naudodami 0,2N HCL (tūris bus didesnis nei 100 ml.)
4.3 procentai vandenilio peroksido:
a. Pipete įpilkite 2,5 ml 30 procentų vandenilio peroksido (pradinio tirpalo) į 25 ml matavimo kolbą ir praskieskite iki žymės distiliuotu vandeniu pH 4,5
5. 37 procentai formaldehido pH 9.0: a. Sureguliuokite pakankamą formaldehido kiekį (100 ml) iki pH 9,0 naudodami 0,1 N NaOH (maždaug 20 ml formaldehido vienam mėginiui prieš reguliuojant pH).
Želatinos virškinimo vieneto analizės metodas (GDU) – tęsinys.
6. 0.100 N NaOH: (perkamas standartizuotas) a. Pradinis tirpalas: standartizuotas 0,100 N
E. Procedūra:
1. Fermentų paruošimas:
a. Fermentų preparato skaičiavimas
Svoris {{0}} / tikslinė veikla (apie 0,05 g arba 50 mg)
A. Tiksliai pasverkite fermentą į 50 ml matavimo kolbą
B. Įpilkite 8,3 ml buferinio tirpalo.
b. Leiskite pastovėti 30 minučių kambario temperatūroje.
C. Atskieskite iki 50 ml, naudodami pH 4,5 distiliuotą vandenį, įdėkite nedidelę maišymo juostelę ir maišykite dar 10–15 minučių.
2. Fermentų procedūra:
a. Pipete įpilkite 25 ml želatinos substrato į kiekvieną iš dviejų 100 ml stiklinių su maišymo juostelėmis ir įdėkite jas į 45 laipsnių vandens vonią 5 minutėms – vieną tiriamajam tirpalui, kitą – tuščiam tirpalui.
b. Bandomasis sprendimas:
1) Į stiklinę, skirtą tiriamajam tirpalui, įpilkite 1.0 ml bromelaino fermento miltelių tirpalo, nustatykite laiką ir pasukite.
2) Lygiai po 20 minučių inkubacijos 45 laipsnių temperatūroje įpilkite 0,1 ml 3 procentų vandenilio peroksido ir pasukite.
3) Inkubuokite dar 5 minutes.
4) Išimkite stiklinę iš vandens vonios ir nuolat maišydami įkiškite pH zondą.
5) Užrašykite pH po 10 sekundžių (pradinis pH)
6) Nustatykite pH 6.{2}} naudodami 0,1 N NaOH. (Maždaug 2-4 ml)
*Pastaba: reguliuodami pH iki 6.{1}} būkite atsargūs, kai pH 5,8; pH didėja lėtai ir nedidelis NaOH pridėjimas šiuo metu žymiai padidins pH.
7) Nuolat maišydami įpilkite 10 ml 37 procentų formaldehido pH 9,0.
8) Užrašykite pH po 10 sekundžių ir 1 minutės.
9) Titruokite iki pH 9.0 su 0,1 N NaOH.
10) Užrašykite titravimo tūrį.
Tai yra testo titras, T. c.
Tuščias sprendimas: Tuščias tirpalas turi būti paleistas kartu su bandomuoju tirpalu. Tai pasiekiama pradėjus tuščiojo tirpalo nustatymą praėjus 12 minučių nuo tiriamojo tirpalo pradžios. Tai suteikia jums laiko užbaigti bandomojo tirpalo tyrimą, o tada pradėti tuščią tirpalą. 1) Į stiklinę, skirtą tuščiajam tirpalui, įpilkite 0,1 ml 3 procentų vandenilio peroksido ir pasukite.
2) Lygiai po 20 minučių inkubacijos 45 laipsnių temperatūroje įpilkite 1,0 ml bromelaino tirpalo ir pasukite.
3) Inkubuokite dar 5 minutes.
ŽELATINOS VIRŠKINIMO VIENETAS ANALIZĖS METODAS (GDU) - tęsinys.
4) Išimkite stiklinę iš vandens vonios ir nuolat maišydami įkiškite pH zondą.
5) Užrašykite pH po 10 sekundžių (pradinis pH)
6) Nustatykite pH 6.{2}} naudodami 0,1 N NaOH. (Apytiksliai 2-4 ml)*Žr. pastabą aukščiau.
7) Nuolat maišydami įpilkite 10 ml 37 procentų formaldehido pH 9,0.
8) Užrašykite pH po 10 sekundžių ir 1 minutės.
9) Titruokite iki pH 9.0 su 0,1 N NaOH.
10) Užrašykite titravimo tūrį. Tai tuščias titras, B.
F. Skaičiavimas:
1. Apibrėžimas: vienas želatinos skaidymo vienetas yra tas fermento kiekis, kuris po 20 minučių virškinimo 45 laipsnių temperatūroje išskirs 1 mg amino azoto iš standartinio želatinos tirpalo, kurio pH 4,5 arba pH 5,5 (GDU pH 4,5 arba pH 5,5).
GDU/g {{0}} (TB) x 14 x N x 50 Wt (g) Kur: T=Bandomasis titras (ml 0.1 N NaOH) B=Tuščias titras (ml 0,1 N NaOH) N=Standartizuoto NaOH normalumas (ty 0,100) Wt (g)=Pradinė fermento masė
G. Bandymo parametrai:
1. Fermentų preparatai skiedžiami iki maždaug 0,001 g/ml (1 mg/ml) arba bromelaino fermento miltelių koncentrato koncentracija yra maždaug 1-2 GDU/ml. Siekiant užtikrinti metodo tikslumą, kiekvieną kartą tikrinama etaloninė medžiaga.
„Guanjie“ tiekia birius bromelaino miltelius, naudodamas GDU bandymo metodą. Mūsų gamybos procesas vyksta CGMP standartinėse dirbtuvėse, naudojant tris gamybos linijas dviejose gamyklose ir dvi nepriklausomas laboratorijas. Jei turite klausimų apie mūsų gaminius, susisiekite su mumis elinfo@gybiotech.com.
